Akım sitometrisi, kan, kemik iliği ya da vücut sıvılarındaki hücreleri tek tek inceleyerek hangi türe ait olduklarını ortaya koyan bir laboratuvar yöntemidir. İmmünfenotipleme adı, hücrelerin bağışıklık belirteçlerine göre sınıflandırılmasını anlatır. Yöntem, hücrelerin yüzeyinde ve içinde bulunan belirli proteinleri tanıyan floresan boyalı antikorlardan yararlanır. Böylece normal hücre toplulukları ile olağan dışı özellik taşıyan hücreler birbirinden ayrılabilir. Lösemi ve lenfomaların alt tiplendirilmesinde, bağışıklık durumunun değerlendirilmesinde ve tedavi sonrası izlemde başvurulan temel yöntemlerden biridir.
Akım Sitometrisi (İmmünfenotipleme) Nedir ve Hücreler Nasıl Tanınır?
Akım sitometrisi, sıvı içinde asılı duran hücrelerin ince bir akış kanalında tek sıra halinde dizilerek bir lazer ışınının önünden geçirilmesi esasına dayanır. Her hücre ışının önünden geçerken ışığı farklı yönlere saçar ve cihaz bu saçılmayı ayrı ayrı algılar. Işığın ileri yöndeki saçılması hücrenin büyüklüğü hakkında, yana doğru saçılması ise hücre içindeki taneciklerin ve iç yapının karmaşıklığı hakkında bilgi verir. Bu iki özellik bile lenfosit, monosit ve granülosit gibi ana hücre gruplarını birbirinden ayırmaya yardım eder. Asıl ayrıntılı tanıma ise hücreye bağlanan floresan boyalı antikorlarla yapılır. Her antikor yalnızca belirli bir proteini tanır ve lazerle uyarıldığında kendine özgü renkte ışık yayar. Cihaz aynı hücrede birçok farklı rengi eş zamanlı ölçtüğü için bir hücrenin hangi proteinleri taşıdığı birlikte görülebilir. Kısa sürede çok sayıda hücre tek tek ölçüldüğünden küçük hücre toplulukları bile ayırt edilebilir. Elde edilen veriler bilgisayar ortamında grafiklere dönüştürülür ve uzman tarafından hücre kümeleri halinde yorumlanır.
İmmünfenotipleme Hücre Yüzeyindeki Hangi Belirteçleri Değerlendirir?
Akım sitometrisinde incelenen proteinlerin çoğu, uluslararası ortak bir sistemle adlandırılmış ve "CD" kısaltmasıyla başlayan belirteçlerdir. Bu ortak adlandırma sayesinde dünyanın farklı laboratuvarlarında aynı protein aynı adla anılır ve raporlar karşılaştırılabilir. CD45 hemen tüm beyaz kan hücrelerinde bulunur ve hücrelerin olgunluk düzeyine göre farklı yoğunlukta görülerek genç hücrelerin ayırt edilmesine yardım eder. CD3 T lenfositleri tanımlarken CD4 yardımcı T hücrelerini, CD8 ise hücre öldürücü T hücrelerini gösterir. CD19 ve CD20 B lenfosit soyuna ait hücrelerde bulunur. Doğal öldürücü hücreler (NK hücreleri) ise kendilerine özgü belirteç birlikteliğiyle ve T hücre belirtecini taşımamalarıyla tanınır. CD34 genç kök hücrelerin ve öncül hücrelerin göstergesi olarak kullanılır. Miyeloid hücreler, yani granülosit ve monosit soyundan gelen hücreler de kendi belirteç gruplarıyla ayrılır. Yüzey belirteçlerinin yanında bazı proteinler yalnızca hücrenin içinde bulunduğundan, hücre zarı özel işlemlerle geçirgen hale getirilerek iç belirteçler de incelenebilir. Tek bir belirteç çoğu zaman yeterli olmaz; hücre soyu ve olgunluk evresi birden fazla belirtecin birlikte taşınma biçimiyle belirlenir.
Akım Sitometrisi Hangi Durumlarda İstenir?
Akım sitometrisi en sık, kan sayımında açıklanamayan lenfosit artışı görüldüğünde ya da kan yaymasında olağan dışı görünümlü hücreler saptandığında istenir. Lösemi ve lenfoma şüphesinde hastalığın var olup olmadığının araştırılması ve alt tipinin belirlenmesi amacıyla başvurulan yöntemlerden biridir. Kemik iliğinde antikor üreten plazma hücrelerinden kaynaklanan hastalıkların değerlendirilmesinde de kullanılır. Paroksismal noktürnal hemoglobinüri (PNH) araştırmasında belirli yüzey proteinlerini kaybetmiş hücrelerin aranması bu yöntemle yapılır. Sık ya da ağır enfeksiyon geçiren kişilerde bağışıklık yetmezliği araştırılırken T, B ve doğal öldürücü hücrelerin sayısı değerlendirilir. HIV ile yaşayan kişilerde CD4 lenfosit sayısının düzenli izlenmesi bağışıklık durumunun takibinde yer alır. Organ nakli ve kök hücre nakli süreçlerinde toplanan üründeki kök hücrelerin sayılması ve nakil sonrası bağışıklık sisteminin yeniden yapılanmasının izlenmesi için de istenir. Lösemi tedavisi sırasında ve sonrasında geride kalmış çok az sayıdaki hastalıklı hücrenin araştırılması, yani kalıntı hastalık takibi de yöntemin önemli kullanım alanlarındandır.
Akım Sitometrisi İçin Hangi Örnekler Kullanılır ve Nasıl Alınır?
Akım sitometrisi için en sık kullanılan örnek, koldaki toplardamardan alınan periferik kandır. Kan örneği sıradan bir kan alma işlemiyle alınır ve test öncesinde aç kalmak ya da özel bir hazırlık yapmak gerekmez. Kemik iliği aspiratı, kemik iliği incelemesi sırasında ince bir iğneyle çekilen sıvı kısımdır ve kemik iliğindeki hücrelerin tiplendirilmesinde kullanılır. Lenf nodu ya da başka dokulardan alınan biyopsi örnekleri, laboratuvarda parçalanarak hücre süspansiyonu (hücrelerin sıvı içinde dağılmış hali) haline getirildikten sonra incelenebilir. Beyin omurilik sıvısı, belden yapılan girişimle alınır ve hastalığın sinir sistemine yayılıp yayılmadığının araştırılmasında değerlendirilir. Akciğer zarı ile göğüs duvarı arasında biriken plevra sıvısı ve karın boşluğunda biriken sıvı da hücre içeriği açısından incelenebilir. Bronkoalveolar lavaj, bronkoskopi sırasında akciğerin alt bölümlerinin yıkanmasıyla elde edilen sıvıdır ve akciğerdeki hücre dağılımını gösterir. Kan ve kemik iliği örnekleri pıhtılaşmayı önleyen maddeler içeren tüplere alınır; tüp türü laboratuvarın talimatına göre EDTA'lı ya da heparinli olarak seçilir. Pıhtılaşmış bir örnekte hücreler birbirine yapışıp sayılamaz hale geldiğinden bu tür örnekler çalışılamaz.
Örneğin Laboratuvara Ulaştırılmasında Nelere Dikkat Edilir?
Akım sitometrisi canlı ve yapısı bozulmamış hücreler üzerinde çalışır; bu nedenle örneğin taşınma koşulları sonucun güvenilirliğini doğrudan etkiler. Örnekler genellikle oda sıcaklığında tutulur ve laboratuvara mümkün olduğunca hızlı ulaştırılır. Örneğin dondurulması hücre zarını parçaladığı için kabul edilmez. Aşırı sıcakta bekletilmesi ya da güneş altında kalması da hücrelerin bozulmasını hızlandırır. Uzun süre bekleyen örneklerde hücre canlılığı azalır, belirteçlerin ışıma şiddeti değişebilir ve bazı hücre grupları olduğundan az görünebilir. Canlılığın yetersiz bulunduğu durumlarda laboratuvar yeni örnek isteyebilir ve test tekrarlanabilir. Beyin omurilik sıvısında hücreler çok hızlı bozulduğundan bu örneğin bekletilmeden, alınır alınmaz laboratuvara iletilmesi gerekir. Örnek kabının üzerine hasta bilgilerinin, örnek türünün ve alınma zamanının yazılması, laboratuvarın örneğin ne kadar beklediğini değerlendirebilmesini sağlar.
Akım Sitometri Sonucu Nasıl Değerlendirilir?
Akım sitometri sonucu tek bir sayı olarak değil, örnekteki hücre gruplarının oranları ve bu hücrelerin taşıdığı belirteç profilleri olarak raporlanır. Raporda hangi hücre topluluklarının bulunduğu, bunların hangi CD belirteçlerini taşıdığı ve olağan görünümden sapma olup olmadığı açıklanır. Değerlendirmenin temel sorusu, örnekte anormal özellik gösteren bir hücre topluluğunun bulunup bulunmadığıdır. Tek bir hücreden çoğalmış ve aynı özellikleri taşıyan hücre topluluğuna klonal topluluk denir. Klonal bir topluluğun varlığı kan hastalığını düşündürebilir; ancak bazı enfeksiyon ve iltihabi durumlarda da geçici değişiklikler görülebildiğinden bulgu klinik tabloyla birlikte ele alınır. Normal hücrelerde belirteçler belirli bir sırayla ve belirli yoğunlukta ortaya çıkar; bu düzenin bozulması olağan dışı bir sürece işaret edebilir. Rapor, hematopatoloji alanında deneyimli uzmanlar tarafından yorumlanır ve genellikle bir açıklama bölümüyle birlikte sunulur. Sonucun anlamı, testin hangi amaçla istendiğine göre değişir; tiplendirme, bağışıklık değerlendirmesi ya da izlem amaçlı raporlar farklı bilgiler içerir.
Lösemi ve Lenfoma Alt Tiplerinin Belirlenmesinde Akım Sitometrisi Ne Söyler?
Lösemi ve lenfomalar, köken aldıkları hücre soyuna ve olgunluk evresine göre birçok alt tipe ayrılır. Akım sitometrisi, hastalıklı hücrelerin hangi soydan geldiğini ve ne kadar olgun olduklarını belirteç profili üzerinden ortaya koyar. Akut miyeloid lösemide genç hücreler miyeloid soya ait belirteçler taşırken akut lenfoblastik lösemide B ya da T lenfosit soyuna ait genç hücre belirteçleri öne çıkar. CD34 gibi genç hücre belirteçlerinin varlığı, hücrelerin olgunlaşmamış evrede kaldığını düşündürebilir. Kronik lenfositik lösemide olgun görünümlü B lenfositlerinin kendine özgü bir belirteç birlikteliği taşıdığı görülür. Bazı lenfoma türlerinde de kan, kemik iliği ya da doku örneğindeki hücrelerin belirteç profili alt tipin ayrımına katkı sağlar. Alt tipin belirlenmesi, hastalığın seyrinin öngörülmesine ve tedavi planlamasının yapılmasına yardım eder. Ayrıca hastalığın başlangıçtaki belirteç profili kayıt altına alınır ve sonraki izlem incelemelerinde karşılaştırma için kullanılır. Bu değerlendirme tanı sürecinin bir parçasıdır ve diğer incelemelerle birlikte sonuca ulaşılır.
Akım Sitometrisi Lenfosit Alt Gruplarının Değerlendirilmesinde Nasıl Kullanılır?
Lenfositler tek tip hücreler değildir; T lenfositleri, B lenfositleri ve doğal öldürücü hücreler bağışıklık sisteminde farklı görevler üstlenir. Akım sitometrisi bu grupların her birini ayrı ayrı sayarak bağışıklık sisteminin hangi kolunda sorun olabileceğini gösterir. T lenfositleri CD3 ile, bunların alt grupları ise CD4 ve CD8 ile ayrılır. B lenfositleri CD19 ya da CD20 ile, doğal öldürücü hücreler ise kendi belirteç birlikteliğiyle belirlenir. Sonuçlar hem oran hem de mutlak sayı olarak verilebilir; mutlak sayı hesaplanırken kan sayımındaki lenfosit değeri de hesaba katılır. Doğuştan bağışıklık yetmezliklerinde belirli bir hücre grubunun hiç bulunmaması ya da belirgin azalması tanı sürecine yön verebilir. HIV ile yaşayan kişilerde CD4 lenfosit sayısının zaman içindeki değişimi bağışıklık durumunun izlenmesinde kullanılır. Kök hücre nakli ve organ nakli sonrasında bu grupların yeniden oluşma hızı, bağışıklık sisteminin toparlanmasının değerlendirilmesine yardım eder. Bağışıklığı baskılayan tedaviler alan kişilerde de lenfosit alt gruplarındaki değişiklikler izlenebilir.
Kalıntı Hastalık (MRD) Takibinde Akım Sitometrisinin Yeri Nedir?
Kalıntı hastalık ya da ölçülebilir kalıntı hastalık (MRD), tedavi sonrasında mikroskopla görülemeyecek kadar az sayıda kalmış hastalıklı hücreleri ifade eder. Kan yayması ve kemik iliği incelemesinde her şey olağan görünse bile vücutta çok az sayıda lösemi hücresi kalmış olabilir. Akım sitometrisi, çok sayıda normal hücre arasında bu az sayıdaki anormal hücreyi belirteç profilindeki farklılıklar sayesinde yakalayabilir. Bu amaçla hastalığın başlangıçtaki belirteç özellikleri ve normal kemik iliği hücrelerinin olgunlaşma düzeni referans olarak kullanılır. Kalıntı hastalığın saptanıp saptanmaması, tedaviye verilen yanıtın ne ölçüde derin olduğunu değerlendirmeye yardım eder. Bu bilgi, tedavi sürecinin planlanmasında ve hastalığın yeniden ortaya çıkma olasılığının öngörülmesinde diğer bulgularla birlikte kullanılır. Kalıntı hastalık araştırması genellikle kemik iliği aspiratında yapılır ve örneğin kalitesi sonucun güvenilirliğini belirgin biçimde etkiler. Kanla karışmış bir kemik iliği örneğinde hücreler seyrelebileceği için sonuç olduğundan düşük görünebilir. Akım sitometrisi ile saptanamayan durumlarda moleküler yöntemler tamamlayıcı bilgi sunabilir.
Akım Sitometrisi ile Periferik Yayma ve Kemik İliği Morfolojisi Neden Birlikte Değerlendirilir?
Akım sitometrisi hücrelerin taşıdığı proteinleri gösterir, ancak hücrelerin mikroskop altındaki görünümünü tek başına ortaya koymaz. Periferik yayma ve kemik iliği morfolojisi, hücrelerin şekli, çekirdek yapısı ve olgunluk görünümü hakkında bilgi verir. Bu iki bakış açısı birbirini tamamlar; morfolojide şüpheli görülen hücrelerin kimliği akım sitometrisiyle aydınlatılabilir. Akım sitometrisi tek başına tanı koydurmaz ve bulguları doku incelemesi, sitogenetik testler ve moleküler testlerle birlikte yorumlanır. Sitogenetik ve moleküler testler hücrelerdeki DNA ve kromozom değişikliklerini gösterirken akım sitometrisi hücre yüzeyindeki ve içindeki proteinleri gösterir. Lenfoma şüphesinde lenf nodu dokusunun yapısını gösteren patolojik inceleme, akım sitometrisinin veremeyeceği doku mimarisi bilgisini sağlar. Bazı hastalıklarda örnek süspansiyon haline getirilirken belirli hücreler kaybolabildiğinden doku incelemesi bu eksikliği giderebilir. Tüm bu yöntemlerin sonuçları bir araya getirildiğinde hastalığın sınıflandırılması daha sağlam bir temele oturur.
Akım Sitometri Sonucunu Etkileyen Faktörler Nelerdir?
Örneğin alınmasından laboratuvara ulaşmasına kadar geçen süre ve bu sürede maruz kaldığı sıcaklık, akım sitometri sonucunu etkileyen başlıca etkenlerdir. Hücre sayısının az olduğu örneklerde, özellikle beyin omurilik sıvısı gibi hücreden fakir sıvılarda, değerlendirilebilecek hücre miktarı yetersiz kalabilir. Pıhtı içeren örneklerde hücreler kümeleşir ve sayım güvenilirliğini yitirir. Hemoliz, yani kırmızı kan hücrelerinin parçalanması, örneğin kalitesini düşürebilir ve yorumlamayı zorlaştırabilir. Yakın zamanda uygulanan kemoterapi, hücre sayılarını azaltabilir ve hastalıklı hücrelerin belirteç özelliklerini değiştirebilir. Steroid yapılı ilaçlar lenfosit sayılarında ve dağılımında belirgin değişikliklere yol açabilir. Hedefe yönelik antikor ilaç grupları, hedef aldıkları belirteci hücre yüzeyinde maskeleyebilir ya da o belirteci taşıyan hücreleri azaltabilir; bu nedenle kullanılan ilaçların laboratuvara bildirilmesi önemlidir. Enfeksiyonlar lenfosit alt gruplarında geçici değişikliklere neden olabilir ve bağışıklık değerlendirmesinin zamanlamasını etkileyebilir. Çocuklarda lenfosit oranları yaşa göre belirgin farklılık gösterdiğinden sonuçlar yaşa uygun referans aralıklarıyla karşılaştırılır.
Akım Sitometri Sonucuyla Hangi Bölüme Başvurulur, Süreç Nasıl İlerler?
Akım sitometrisi çoğunlukla bir uzmanlık bölümünün yürüttüğü tanı ya da izlem sürecinin parçası olarak istenir. Erişkinlerde lösemi, lenfoma ve plazma hücre hastalıkları şüphesinde hematoloji bölümü süreci yönetir. Çocuklarda benzer durumlar çocuk hematolojisi ve onkolojisi bölümünde değerlendirilir. Tekrarlayan ya da ağır enfeksiyonlar nedeniyle bağışıklık yetmezliği araştırılan kişiler immünoloji bölümüne yönlendirilir. HIV ile yaşayan kişilerde CD4 lenfosit izlemi enfeksiyon hastalıkları bölümü tarafından planlanır. Kök hücre nakli merkezleri, nakil öncesinde toplanan kök hücrelerin sayılmasını ve nakil sonrasında bağışıklık sisteminin toparlanmasını bu yöntemle takip eder. Örneklerin incelenmesi ve raporlanması hematopatoloji laboratuvarında yapılır. Rapor çıktıktan sonra sonuçlar, testi isteyen hekim tarafından diğer tetkiklerle birlikte değerlendirilir ve gerekirse ek incelemeler planlanır.